10月8日，清华大学生命科学学院柴继杰教授研究组和隋森芳院士研究组合作在国际顶尖期刊《科学》（Science）在线发表了题为《NLRC4蛋白诱导自激活机制的结构和生化基础》（Structural and Biochemical Basis for Induced Self-propagation of NLRC4）的研究长文（Research Article），报道了通过单颗粒冷冻电子显微技术（冷冻电镜）解析的小鼠PrgJ-NAIP2-NLRC4ΔCARD复合物（炎症小体）分辨率为6.6埃的三维结构，并通过大量的生化和结构研究揭示了NAIP-NLRC4炎症小体中NLRC4蛋白诱导自激活的分子机制。清华大学生命学院博士后胡泽汗、博士后周强和博士研究生张晨璐为本文共同第一作者，柴继杰教授和隋森芳院士为本文共同通讯作者。

病原微生物感染严重威胁人类健康，炎症反应等天然免疫反应是机体防御病原微生物侵染的第一道防线。NOD样受体(nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors, NLRs)是位于胞质内非常重要的一类模式识别受体，通过感知胞内外源性病原微生物产物或内源性危险信号，起始多种包括炎症小体在内的多种蛋白复合物的组装，从而激活多条免疫相关信号通路，引发天然免疫反应。NOD样受体家族蛋白的功能异常会引起关节炎等各种自身免疫疾病、肥胖等各种代谢综合症、炎症性肠病以及肿瘤等众多疾病的发生。

NLRC4是NOD样受体家族中的一员，主要感受细菌的鞭毛蛋白和III型分泌系统等成分，从而引发对相关病原菌入侵的免疫应答。NLRC4在正常情况下通过自抑制作用处于静息状态；当病原菌成分进入细胞内时，会被另一类NOD样受体家族蛋白--NAIP亚家族蛋白所识别并激活，从而进一步活化NLRC4；活化的NLRC4会发生自身多聚化并招募Caspase-1，形成炎症小体，产生一系列的免疫应答反应。

柴继杰教授研究组过去十年一直以NOD样受体家族的结构与功能作为主要研究方向。2013年，柴继杰教授研究组首次解析了小鼠NLRC4蛋白处于自抑制状态下的晶体结构，通过结构分析和生化实验揭示了该蛋白在正常情况下维持自抑制状态的分子机制，该项研究成果发表于《科学》（Science）上（http://www.sciencemag.org/content/341/6142/172.full）。该论文发表后，Science Signaling和SciBX: Science-Business eXchange杂志为本文专门写了评论文章，Nature CHINA杂志以研究亮点进行了报道，并被F1000 Prime所推荐。

图1 PrgJ-NAIP2-NLRC4ΔCARD复合物结构示意图。

之后，柴继杰教授研究组和隋森芳院士研究组合作，展开对激活状态下NAIP-NLRC4炎症小体的结构和功能研究。经过多次的尝试，最终利用冷冻电镜方法解析了“PrgJ-NAIP2-NLRC4ΔCARD”复合物平均分辨率为6.6埃的三维结构。该结构为10-12个NAIP2/NLRC4蛋白分子相互作用并聚合成一个盘状结构（图1）。纳米金颗粒标记实验表明该盘状结构中，只有一个NAIP2蛋白分子，其余的均为NLRC4蛋白分子。此外，在对“PrgJ-NAIP2-NLRC4ΔCARD”复合物样品的电镜观察中，还发现了部分未完全闭合的钩状结构。该钩状结构的电镜分析结果显示位于钩状结构一端的蛋白分子具有与其它蛋白分子不同的密度，提示该端点处的蛋白分子为NAIP2。该结果一方面符合PrgJ首先结合NAIP2进而激活NLRC4的生化机制，另一方面也同纳米金颗粒标记实验结果一致。

该钩状结构相当于“PrgJ-NAIP2-NLRC4”复合物组装过程的一个中间状态，表明“PrgJ-NAIP2-NLRC4”复合物的组装是一种具有方向性的梯次激活过程，结合了配体的NAIP2起始了这一激活过程。由于NLRC4蛋白并不结合配体，所以随后的NLRC4蛋白的激活仅依赖于上一个活化的NLRC4蛋白，所以NLRC4蛋白以一种类似于阮病毒“自我复制”的方式激活并组装成寡聚体结构。

NLRC4蛋白分子的“催化表面”和“受体表面”参与了该激活过程：第一个NLRC4蛋白分子的催化表面结合下一个NLRC4蛋白分子的受体表面，进而引起其构象发生改变，从而形成新的催化表面，进而结合和激活随后的NLRC4蛋白分子。序列比对结果显示，NAIP蛋白和NLRC4蛋白的催化表面非常相似，关键氨基酸完全一致；而NAIP蛋白和NLRC4蛋白的受体表面则完全不同。因此，NAIP蛋白运用了与NLRC4蛋白高度相似的催化表面起始了NLRC4蛋白的“自我复制”的激活过程，其受体表面的不匹配性保证了NAIP-NLRC4炎症小体复合物中有且仅有一个NAIP蛋白分子。

图2 NAIP-NLRC4炎症小体激活过程示意图。

以上所有的结构分析均得到了体外生化实验的验证，说明了NLRC4蛋白以类似于阮病毒的“自我复制”的方式激活并组装成寡聚体结构，结合了配体的NAIP蛋白作为“种子”起始了这一激活过程（图2）。这种激活方式在该类蛋白的激活方式中还从未被发现，这不仅揭示了NAIP激活NLRC4的具体分子机制，更揭示了NLRC4的“自我放大”作用，这种作用机制保证了NLRC4蛋白对于危险信号具有更强的敏感性，为机体及时有效的启动免疫应答反应提供保障。此外，该研究结果也为研究其它NOD样受体的作用机制提供了借鉴意义。

清华大学生命学院王宏伟教授和范仕龙博士、四川大学程伟教授以及北京生命科学研究所邵峰研究员和赵越博士也参与了部分工作。本项研究得到了科技部重大科学研究计划、国家自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心以及中国博士后科学基金的资助。（摘自清华新闻网）

论文链接：www.sciencemag.org/content/early/2015/10/07/science.aac5489.full