5月9日，清华大学医学院、结构生物学高精尖创新中心布莱恩·科比尔卡（Brian K. Kobilka）教授研究组于《细胞》 （Cell） 杂志在线发表了题为《G蛋白偶联受体- G蛋白复合物形成过程的结构机理》（Structural Insights into the Process of GPCR-G Protein Complex Formation）的研究论文。论文报道了 beta2 肾上腺素受体（β2AR）融合Gs蛋白羧基端肽段（GsCT）的晶体结构以及GDP结合状态下Gs蛋白（Gs^GDP）的晶体结构，并基于结构首次提出了beta2 肾上腺素受体-Gs蛋白复合物在形成过程的初始阶段可能的分子模型。《细胞》期刊同期还以背靠背的方式发表了布莱恩·科比尔卡教授在斯坦福大学研究组的题为《G蛋白偶联受体-G蛋白复合物的组装》(Assembly of a GPCR-G protein Complex)的研究论文，报道了利用氢氘交换质谱分析和X射线辐射裂解蛋白印记质谱分析研究 beta2 肾上腺素受体与Gs蛋白复合物形成的动态过程的工作。两篇论文相互印证，共同揭示了G蛋白偶联受体与 G蛋白复合物形成的分子机理。

G蛋白偶联受体（GPCR）家族在人体中有800多个成员，在视觉，嗅觉，味觉，以及激素和神经递质的信号转导中发挥着重要的生理功能，同时也是关键的药物研发靶点。GPCR作为膜受体蛋白，对外感知胞外的配体信号，对内结合G蛋白或者Arrestin，将信号向下游传递，调节细胞功能。在激动剂的作用下，GPCR会与二磷酸鸟苷（GDP）结合状态的G蛋白，形成短暂的复合物（GPCR-G^GDP），诱发GDP的释放，得到无核酸结合的GPCR-G蛋白复合物（GPCR-G^empty）。三磷酸鸟苷（GTP）随后与GPCR-G^empty状态下的G蛋白结合，引起 G蛋白解离成Gα 与 Gβγ亚基，进而激活下游的靶蛋白，传递细胞信号（图1）。 

图1 GPCR与G蛋白复合物形成过程示意图

布莱恩·科比尔卡教授在斯坦福大学的课题组在GPCR结构生物学领域做出了开创性的工作。其于2007年首次获得了beta2肾上腺素受体的非激活态高分辨率结构，并于2011年利用模拟G蛋白的纳米抗体稳定beta2肾上腺素受体的激活态构象，获得了其激活态结构。更于2011年发表了beta2肾上腺素受体与Gs蛋白在无核酸状态下（β2AR-Gs^empty）的复合物的晶体结构，首次在原子水平观测到信号从配体传递到受体再到G蛋白，该研究是GPCR领域里程碑式的成果。值得注意的是，在获得β2AR-Gs^empty结构的研究中，研究者们使用核苷酸酶Apyrase水解去除复合物中的GDP，从而获得更加稳定的无核苷酸结合的GPCR-G蛋白复合物（GPCR-G^empty） 。使用Apyrase水解GDP以获得稳定GPCR-G蛋白复合物的方法，也成为了获得GPCR-G蛋白复合物的通用方法。随着冷冻电镜技术的发展，目前在PDB数据库里面有超过10个不同GPCR-G蛋白复合物的结构，所有的复合物都被稳定在没有核苷酸结合的GPCR-G^empty状态。然而这些复合物结构并没有很好的解释 GPCR与G蛋白结合的特异性。多项研究表明，GPCR与GDP结合的G蛋白之间存在一个中间状态的复合物。这个中间态的复合物可能代表了GPCR与G蛋白特异性识别的初始状态。但由于该复合物是一个不稳定的中间态，其结构信息很难获得。

相比于非激活态的GPCR，激活态的GPCR结构上最显著的特点在于第六个跨膜螺旋的外移（ 10埃甚至更远的距离）。布莱恩·科比尔卡教授研究组利用多种技术证明：在只有激动剂结合的情况下，beta2 肾上腺素受体无法稳定在激活构象，需要同时在胞内区域有其他蛋白（纳米抗体或者G蛋白）稳定其激活态结构。布莱恩·科比尔卡教授多年以前启动一个课题，试图将Gs蛋白羧基端的肽段融合在beta2 肾上腺素受体的羧基端，以获得其稳定在激活态的结构，但是该课题没有成功。其在清华大学的研究组改进了蛋白编辑策略，将Gs蛋白羧基端的14个氨基酸（GsCT）融合在beta2 肾上腺素受体的胞内第三个环状区域，并引入二硫键将GsCT稳定在其结合位置，最终获得了3.7埃的 beta2 肾上腺素受体激活态下的晶体结构。在该结构中观察到的 Gs蛋白羧基端与受体相互作用的方式不同于2011年解析的β2AR-Gs^empty复合物（PDB：3SN6）。Gs蛋白羧基端的两个带电的氨基酸E392^Gs和R389^Gs与受体相互作用，而在之前的β2AR-Gs^empty复合物中与受体结合的两个氨基酸Y391^Gs和H387^Gs却指向了相反的方向（图2）。分子动力学模拟表明这种结合方式几乎与β2AR-Gs^empty 的复合物中观察到的结合方式一样稳定。

图2 beta2 肾上腺素受体与Gs蛋白C末端的14个氨基酸（GsCT）融合蛋白的晶体结构（A），在该结构中，带电荷的氨基酸E392^Gs和R389^Gs与β2AR相互作用，而Y391^Gs和H387^Gs不参与β2AR的相互作用（B）。这一相互作用模式与β2AR-Gs^empty（PDB： 3SN6）结构里观察到的方式相反（C）

同时，研究组获得了2.8埃的GDP结合状态下Gs蛋白（Gs^GDP）的晶体结构，在该结构中，Gs蛋白羧基端的Y391^Gs和H387^Gs与Gs蛋白内部其它氨基酸形成了相互作用，而E392^Gs和R389^Gs则暴露在Gs蛋白的表面。因此推测E392^Gs和R389^Gs 更有可能参与GPCR受体与G蛋白之间的初始相互作用。随后研究组通过多种生物化学手段和分子动力学模拟验证了E392^Gs和R389^Gs 在受体与G蛋白形成复合物过程中的重要作用。最后研究组搭建了beta2 肾上腺素受体与GDP结合状态下Gs蛋白的复合物（β2AR-Gs^GDP）的模型，并提出了从 Gs^GDP，到β2AR-Gs^GDP，最后到β2AR-Gs^empty的复合物形成的动态模型（图3）。 

图3 β2AR与Gs蛋白形成复合物的动态模型。在Gs^GDP状态E392Gs和R389^Gs暴露在Gs蛋白表面（A）。Gs蛋白羧基端肽段经过小的构象变化（B）可以与β2AR形成中间态复合物β2AR-Gs^GDP（C），在该复合物状态下，Gs蛋白利用带电氨基酸E392^Gs和R389^Gs与β2AR相互作用。随着GDP的释放， β2AR-Gs^GDP 复合物经过构象变化，成为无核酸结合的β2AR-Gs^empty复合物（D），在β2AR-Gs^empty复合物中，Gs利用Y391^Gs和H387^Gs和β2AR相互作用

清华大学医学院布莱恩·科比尔卡教授与刘翔宇博士为本文的共同通讯作者。清华大学刘翔宇博士， 博士生许心宇，以及斯坦福大学Daniel Hilger博士为本文共同第一作者。清华大学医学院刘洪涛博士、孙晓鸥博士、斯坦福大学杜洋博士（即将成为香港中文大学（深圳）科比尔卡新药研究院Tenure-track助理教授）参与了本项研究。本课题得到清华-北大生命科学联合中心，北京市高精尖结构生物学中心的资助。

原文链接：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30440-4

来源：清华新闻网