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清华刘晓冬研究组发文揭示抑制钙离子通道的新方式
2017-01-09 14:47:37     毛雪鸥[     ]

1月6日,清华大学医学院生物医学工程系刘晓冬研究组在《e生命》(eLife)期刊在线发表了题为“基于碳末端的多域协同急性抑制L型钙通道”(Cooperative and acute inhibition by multiple C-terminal motifs of L-type Ca2+ channels)的研究长文(article)。论文工作综合利用电生理、定量(FRET )荧光能量共振转移荧光成像、化学诱发异源多肽聚合、以及计算机模型仿真等手段,首次揭示了一种抑制L型电压门控钙离子通道的新型方式——“碳末端介导抑制”(CMI)。

该项研究利用组成性及急性诱发的域间聚合,阐明了通道蛋白碳末端的三个关键域之间的协同法则,论证了碳末端介导抑制(CMI)对通道门控和钙内流的抑制作用,分析了碳末端介导抑制(CMI)机制与钙通道核心门控特性的关联。同时,论文基于帕金森症中重要神经元的仿真计算结果,初步探讨了碳末端介导抑制(CMI)潜在的病生理意义。

清华大学生物医学工程系博士生刘楠、杨亚雄及葛琳为论文的共同第一作者,刘晓冬博士为本文的通讯作者,参与部分工作的作者还包括清华大学博士后刘敏博士以及美国哥伦比亚大学医学院教授亨利·科尔克拉夫特(Henry Colecraft)博士。

A图为碳末端介导抑制(CMI)三元素间的协同组合法则(左)。在其中任何两元素空间距离足够接近的情况下,第三个元素作为调控多肽通过碳末端介导抑制(CMI)方式抑制L型钙通道。通过瞬时性施加小分子(雷帕霉素)连接两个多肽(PCRD和DCRD)后,高峰值、强钙依赖性失活(CDI)的钙电流(右图中粉色)峰值大幅降低(削减约65%)同时钙依赖性失活基本消除(青色)。首次揭示了碳末端介导抑制(CMI)的重要特征:无论碳末端介导抑制(CMI)效力(potency)如何,终态钙依赖性失活的电流幅值维持不变,确保碳末端介导抑制(CMI)能够削减钙内流并定量决定了其极限效力(maximum potency),同时提示碳末端介导抑制(CMI)机制可能与钙依赖性失活等经典过程类似地参与通道的核心门控。B图SNc(黑质纹状体)神经元模型中,钙依赖性失活能够削弱CaV1.3钙电流和自发节律性振荡,进而缓解帕金森症(PD)中的钙超载(粉色),提示可利用钙依赖性失活开发新型的疾病干预手段。

细胞需要钙离子维系正常的生命活动而钙失调(如钙超载等)则会导致多种疾病。细胞膜上的电压门控钙离子(如CaV1.3)通道精确调控钙离子内流及其时空动态,对于心脑等器官的生理机能至关重要,也与心律失常及帕金森症等重大疾病密切相关。因此,抑制CaV1.3等钙通道的机制及方法成为基础研究及应用开发的重要目标。临床上,钙通道抑制剂(也称为拮抗剂)是常用的抗心律失常药;另外,针对阿尔茨海默症的药物迄今尚未攻克,而钙通道拮抗剂是当前研发中的重要先导药物之一。CaV1.3通道开放后能够被流入的钙离子以负反馈形式迅速削弱(即钙依赖性失活),多项研究证实这一过程由重要钙结合蛋白—钙调素(calmodulin)所介导;同时,通道蛋白的碳末端能够通过与钙调素竞争影响通道功能,成为另一类重要的反馈型调控。然而,对于碳末端调控的基本效应仍存在重大争议:一方面碳末端调控能够抑制钙依赖失活,具有上调钙内流的倾向;另一方面有证据表明碳末端削弱通道的开放能力(即电压依赖性激活),进而抑制钙内流。两种对立效应同时发生,那么碳末端对钙内流的影响究竟是怎样的?这是领域内悬而未决的挑战性问题。

刘晓冬研究组从碳末端三个关键域的结构-功能分析出发,发现并建立了三元素协同组合法则:任何两元素如果在空间距离上足够“亲密“,三者将最终形成复合体、将钙调素从通道上驱除、进而改变通道门控特性。基于此法则,利用化学小分子诱导多肽间聚合形成 “亲密”组合,迅速抑制了钙电流瞬态峰值,但并不影响其稳态电流水平,二者共同表现为钙依赖失活的强度降低。结合其它证据,揭示出钙内流能够确保被削弱下调,从而澄清了前述的”矛盾效应”,所依据的基本事实是:碳末端抑制的实质是将钙电流峰值向其稳态值水平压低,其极限抑制效力对应于钙依赖失活的最大强度。这一发现同时提示,碳末端抑制与钙依赖失活同为钙通道的负反馈调控,虽然由不同的事件引发:分别为钙离子与钙调素结合或者是多肽与钙调素竞争,但二者的终态共享相同的核心门控模式,即通道的”抑制“态:超低水平的激活但同时基本不再失活。以上原理及机制预期能够推广至“钙依赖易化”以及“碳末端易化“等上调通道功能的“激动剂”效应,而碳末端调控的高精度结构-功能分析等机制细节,以及其病生理作用,均为后续跟进研究的重要方向。本项研究同时也提供了开发钙通道抑制剂的新范式,神经元模型仿真计算的结果预示:碳末端抑制有望成为帕金森症等疾病的新型干预手段。

刘晓冬实验室致力于“合成电生理学”研究,通过在分子和细胞水平上功能重建重要离子通道及其跨膜信号,研究与通道相关的病生理机制及干预方法。刘晓冬及其课题组在钙离子通道领域的研究重点在于将自反馈调控与干预因子密切相结合,本研究是此方向上继前期工作(《自然》(Nature)2010; 《细胞报导》(Cell Reports)2015; 《通道》(Channels)2016)的最新进展。该项研究得到了国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委、清华大学麦戈文脑科学研究所以及生命科学联合中心(CLS)等方面的支持。(摘自清华新闻网)

论文链接:https://elifesciences.org/content/6/e21989